渗透诱导凝胶-凝胶相分离
动态生命系统的液液相分离产生无膜组织结构，如核仁、应激颗粒和卡哈尔体。液-液相分离是生命科学中一个新兴的挑战，它与包括白内障和神经退行性疾病在内的几种疾病的发展有关。生命组织可以被认为是由凝胶化耗散过程产生的非平衡有组织系统，但目前在人工系统中复制这些特性仍然很困难。
近日，东京大学NaoyukiSakumichi和Takamasa Sakai在Nature Materials期刊发表论文“Percolation-induced gel–gel phase separation in a dilute polymer network”，报道了在稀聚合物-水混合物中耗散网络形成过程中，发现渗透诱导的凝胶-凝胶相分离。稀释体系在渗透阈值处形成单相结构，在凝胶化反应完成后的溶胀过程中自发分离成两个亚毫米尺度的共连续凝胶相(稀释渗透凝胶)。含有99%水的稀释渗凝胶表现出意想不到的疏水性，并诱导皮下组织中脂肪样组织的发育。这些发现支持开发具有先进功能的耗散结构，实现从物理化学到组织工程的不同应用。
在整个渗透过程中，凝胶-凝胶相分离(GGPS)发生在水-聚乙二醇(PEG)二元体系中，在此之前其相分离从未在标准大气中观察到。GGPS是由一种非均相结构诱导产生的，这种非均相结构是在低于特定值的溶质浓度下通过凝胶形成的；凝胶化是一个耗散过程，随后的溶胀过程形成一个亚毫米尺度，两个共连续的凝胶相(图1)。
图1. 产生稀释渗透凝胶和c*凝胶的过程示意图。具有互反应官能团的四官能团聚合物前驱体在含水条件下偶联。活性基团马来酰亚胺(A)和硫醇(B)形成共价键(黄色球体)。稀释渗透(浑浊)凝胶和c*(透明)凝胶分别在c = 10和60 g/L时形成。
聚乙二醇前驱体与水的混相超过了c (~300 g/L)的研究范围。此外，透明凝胶在重叠浓度c*≈60 g/L以上形成(图1和2a)。这里，c*是水合PEG前体结构域吞没整个体系的浓度。这些结果与先前的结果一致，即PEG-水二元体系的LCST高于水的沸点(~130℃)，因此PEG是亲水的。然而，在25°c时，当PEG浓度低于c*时，胶凝溶液变得混浊(图1和2a)。这种行为与关于溶质浓度高于某一特定值时发生相分离的传统观点相矛盾。为了解释这种行为，研究了分别在c = 10和60 g/L时形成的两种具有代表性的凝胶(稀释渗透凝胶和c*凝胶)。当前驱体渗透并形成聚合物网络时，稀释过的凝胶在凝胶点后变得更浑浊(图1和2a)。尽管浑浊，但此时稀释渗透凝胶凝胶在亚毫米范围内没有明显的形态(图2b)。凝胶在溶剂(水)中浸泡一周后，c*和稀释过的凝胶出现肿胀 (图2c)。当凝胶从模具中取出并浸入水中时，凝胶达到了由渗透压力和弹性压力之间的平衡所决定的平衡。当温度升高到90℃时，稀释渗透凝胶凝胶收缩，浑浊度减少，亚毫米级结构消失(图2e，图2b)。常规PEG水凝胶在高温下观察到收缩，这反映了PEG23的疏水性增强。在温度范围内，C *凝胶没有形态变化(图2f，底部)，证实稀释渗透凝胶在低于上限临界溶液温度(UCST)时发生相分离。
图2. 凝胶过程中的云雾和热力学稳定的亚毫米尺度相分离结构：a，稀释渗透(灰线)和c*(黑线)凝胶凝胶化后浊度的时间变化；b，稀释渗透凝胶(上)和c*凝胶(下)溶胀/溶胀前的内部结构(左)和凝胶表面吸收颗粒(右)的CLSM图像；c，稀释渗透凝胶(蓝色三角形)和c*(黑色圆圈)的溶胀比(溶胀度Q)随时间的变化；d，稀释渗透凝胶(上)和c*凝胶(下)溶胀/溶胀后的内部结构(左)和表面吸收颗粒(右)的CLSM图像；e，稀释渗透凝胶(蓝色三角形)和c*(黑色圆圈)的溶胀率随着温度从25℃变化到90℃再变回25℃而减小；f，温度变化过程中稀释渗透凝胶(上)和c*凝胶(下)的CLSM图像。
作者进行时间分辨小角度x射线散射(SAXS)实验来阐明稀释渗透凝胶凝胶和c*凝胶在凝胶化过程中的结构变化(图3a,b)。散射强度(I)是由聚合物浓度归一化(I / c)和显示为一个函数的散射矢量大小(q)。稀释渗透凝胶凝胶在凝胶点之后表现出独特的变化(图3a)。在整个SAXS q范围内，散射强度随时间增加，从聚合物段的尺寸(~0.5 nm)到前体尺寸(~10 nm)的十倍或更多。在前体内分布的q范围内(q > 0.05 Å−1)，稀释渗透凝胶凝胶的强度增量与c*凝胶的明显不同，c*凝胶的强度随时间不变。稀释渗透凝胶具有凝聚区和由此产生的稀疏区。即使在冷凝后，分形关系(I≈q−2)仍然保持不变，这表明在SAXS测量的尺寸范围内没有形成明确的边界。稀释渗透凝胶凝胶的丝状结构通过溶胀过程生长(图3c，顶部)。从模具中取出并浸入水中后，凝胶立即没有结构;但在2h时形成分散的细丝。12 h后，丝形成连续的网状结构。虽然此时已形成丝状结构，但该结构可继续生长，持续溶胀一周。然而，c*凝胶和c*稀释凝胶在相同的时间尺度上都没有特征结构。
图3. 凝胶-凝胶相分离的形成过程：a-b，稀释渗透(a)和c* (b)凝胶的时间分辨SAXS谱。每隔5分钟连续监测凝胶化过程。各种散射曲线(红到蓝)对应凝胶化的进程，黑色曲线代表凝胶点(即溶胶-凝胶过渡点)；c，稀滤凝胶(上)和c*凝胶(下)的CLSM图像显示在25℃的水中溶胀过程。
生命系统中的细胞外基质在不透明度和中尺度结构方面类似于稀释渗透凝胶。为了证明这一点，将处于平衡肿胀状态的圆盘状水凝胶植入大鼠皮下，并在14天内研究与凝胶的生物反应差异(图4)。首先通过对荧光标记的水凝胶进行体内成像来评估降解情况(图4a)。通过分析相对于第0天信号的辐射效率(图4b)，只有稀释过的凝胶整体上显示出荧光信号的逐渐衰减。稀释渗透凝胶的相对荧光在第14天达到约50%，而c*凝胶的相对荧光减少很微妙。作者通过马松三色染色进一步阐明了水凝胶降解和随后的组织替代的生物反应，稀释渗透凝胶最初存在的区域有大量脂肪样组织，而稀释渗透凝胶在第14天仍然在有限的区域存在(图4d)。这些结果表明，不仅稀释渗透凝胶的体积减少，而且随后也发生了脂肪组织的替代。为了进一步研究组织替代机制，发现只有稀释渗透凝胶在体内溶解并被替换为含有血管结构的脂肪组织。这种行为可能是由调节蛋白质迁移和细胞粘附的疏水性引起的。本研究报道了PEG -水凝胶为基础的细胞迁移和组织替代，没有任何特定的生物活性基序(例如，细胞粘附肽(RGD序列))或明显的可降解片段。
图4. 水凝胶在生物体的应用：a，活体大鼠植入皮下层后不同时间点稀释渗透液(上)和c*凝胶(下)具有代表性的体内荧光图像；b，辐射效率相对于第0天的时间过程；c，从大鼠身上取出前(左)和取出后(右)稀释渗透凝胶(上)和c*(下)凝胶；d-e，将稀释渗透凝胶和c*凝胶皮下植入大鼠体内，观察两周后的生物反应，CD68和CD31分别是用于分析巨噬细胞攻击和血管形成的糖蛋白类型，黑色虚线和红色虚线分别表示水凝胶的植入面积和剩余面积。
小结：本文主要研究了在稀释聚合物网络中的渗透引起的凝胶-凝胶相分离现象。研究使用了相互反应的四功能PEG前体合成了水凝胶，并通过多种技术手段对其均匀性进行了研究。实验结果显示，当PEG浓度低于一定值时，凝胶溶液会变得混浊，与传统的溶质浓度高于特定值时的相分离行为相矛盾。通过观察凝胶在水中膨胀和收缩的过程，发现稀释渗透凝胶在脱模后会形成亚毫米级的纤维状网络结构，而浓缩凝胶和膨胀后的凝胶则没有明显的结构。这种纤维状网络结构具有明显的相界面，且尺寸比传统网状结构大。这项研究对于理解凝胶形成和相分离机制具有重要意义。
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