合作作者：Yongxin Lv（吕永新）、Mukan Ji（计慕侃）、Shiguo Wu（吴时国）
主要单位：
上海交通大学 (School of Oceanography; Shanghai Key Laboratory of Polar Life and Environment Sciences; MOE Key Laboratory of Polar Ecosystem and Climate Change, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China)
兰州大学 (Center for Pan‐third Pole Environment, Lanzhou University, Lanzhou, China)
中国科学院深海科学与工程研究所 (Institute of Deep-sea Science and Engineering, Chinese Academy of Science, Sanya, China)
中国极地研究中心 (Laboratory for Polar Science, Polar Research Institute of China, Ministry of Natural Resources, Shanghai, China)
上海交通大学三亚崖州湾深海科技研究院 (Yazhou Bay Institute of Deepsea Sci-Tech, Shanghai Jiao Tong University, Sanya, China)
– 摘要 –
深渊海沟是水深大于6000 m的极端环境，其中巨大的静水压力会影响元素的生物化学循环。最近的研究表明，深渊海沟可能是以前被忽视的固定氮流失的源；然而，静水压力在这一过程中的机理和作用仍在争论中。为此，本论文利用了可持续供应硝酸盐和氧气的深海实验模拟设备（DOES），在不同的静水压力（0.1-115 MPa）下研究了马里亚纳海沟表层沉积物中微生物氮代谢活性、群落结构和代谢功能的变化。本文观察到在有氧条件下高静水压力增强了反硝化活性，而厌氧氨氧化（之前被认为是深渊主导的氮流失途径）未被检测到。此外，本文利用来自马里亚纳海沟原位RNA固定沉积物的宏转录组数据集进一步确认了硝酸盐还原作用和有氧呼吸同时发生。综上所述，本文的研究结果表明，静水压力可以影响微生物对氮循环的贡献，且深渊海沟是一个潜在的氮流失热点。了解静水压力对含氧表层沉积物中厌氧过程的影响，可以拓宽人们对深渊海沟中元素循环的理解。
– 引言 –
深渊海沟是以具有高静水压力（≥ 60 MPa）为典型特征的一类独特的深海生态系统，其深度范围大于6000 m。尽管其环境条件极端，深渊海沟仍然是目前元素循环研究的热点区域之一，具有较高的有机质沉积速率和相对活跃的微生物活动。基于最近一些实验证据和模型结果，生物可利用氮（如NH4+、NO2-和NO3-）在深渊沉积物中可被微生物转化为惰性的气态N2。由此带来的持续氮流失会使原位环境中碳氮比升高，甚至会导致底栖微生物生存受到氮限制，从而进一步改变深渊等深海海底中的生物地球化学过程。因此，全面了解深渊沉积物中氮流失的机制对于剖析这类独特沉积环境中的生物地球化学循环来说是至关重要的。
反硝化和厌氧氨氧化过程是目前已知的主要氮流失途径，且这些过程被广泛认为在厌氧或缺氧条件中发生。在此之前，研究人员已经在各类海沟沉积物中鉴定出参与反硝化和厌氧氨氧化的相关基因。其中，厌氧氨氧化被认为是海沟缺氧沉积物中氮流失的主要过程，其贡献远大于反硝化。前人探究了位于阿塔卡马海沟和克马德克海沟的底部沟轴沉积物，证明了厌氧氨氧化过程的重要性，而反硝化作用通常以较低的速率出现，并且仅限于沉积物的表层。又有研究人员报道了马里亚纳海沟反硝化和厌氧氨氧化的不均匀分布，与斜坡位点相比，氧气消耗更强的底部沟轴沉积物中厌氧氨氧化加剧。然而，反硝化作用对海沟有氧的表层沉积物中氮流失的贡献仍有待研究。
深渊海沟中微生物的生理和代谢活性会受到静水压力的影响。上海交大张宇团队基于长期以来对高压环境下微生物适应性研究，提出了微生物应对极端环境的适应机制——“共适应理论”，即在高压与温度、盐度、氧化还原度等多重环境因子作用下，深海生命演化形成了通用策略以应对环境胁迫，其核心是调控能量分配和抗氧化。因此，本文提出科学假设，即在静水压力极高的深渊海沟沉积物中，反硝化作用是导致深渊海沟含氧表层沉积物中氮流失的有利能量途径。基于以上科学问题和假设，本文以采集自马里亚纳海沟保压保存的表层沉积物为培养样品，利用实验室内自主研发的全海深实验模拟设备（DOES），通过持续供应溶解氧和硝酸盐，在不同的静水压力（0.1、40、70、90和115 MPa）下进行为期75天的连续流动培养（图1），根据微生物群落结构和氮代谢活性的变化、宏基因组和宏转录组、关键氮代谢基因的酶学验证以及原位固定沉积物的宏组学数据，共同解析其背后的机制。
图1. 整体实验设计与分析流程
– 主要结果 –
有氧条件下高静水压促进了微生物硝酸盐还原为氮气活性
根据微生物群落在不同静水压下随时间的氮代谢活性变化以及宏组学数据，发现即使培养期间内持续供应溶解氧，仍观察到了相对恒定的硝酸盐消耗量（38.4–49.5 μmol/d）（图2A），同时参与异化硝酸盐还原第一步的napAB和narGHI基因在较高的静水压力下转录更加活跃（图3）。此外，对于后续的亚硝酸盐还原步骤来说，随静水压力的升高，参与反硝化途径方向的关键基因（nirS、nirK、norBC和nosZ）的转录比例明显增加（图3），且较高压力下的N2O平均净产生速率显著高于常压（图2C）。然而，对于后续的异化亚硝酸盐还原为铵途径，其关键基因（尤其是nirBD）的转录比例随压力升高而减半，具体为在40 MPa和70 MPa时分别减半至40.9%和37.1%，静水压力增加至90 MPa和115 MPa时，nirBD的转录比例则进一步降低到20.7%和24.5%（图3）。这些结果表明，在有氧条件下升高的静水压力促进了微生物硝酸盐还原为氮气，即反硝化途径，而不是异化硝酸盐还原为铵。同时，在整个流动培养系统中也未检测到厌氧氨氧化途径。
图2. 点线图显示在不同静水压力下微生物随时间的氮代谢活性变化
图3. 不同静水压力下马里亚纳海沟沉积物样品中微生物氮代谢基因的转录活性变化
高静水压力下微生物更倾向选择Sec依赖型N2O还原酶
本研究中一个值得注意的现象，随着培养压力的升高，参与反硝化途径最后一步的关键基因nosZ的转录活性单调增强，尤其在115 MPa下其转录活性达到最高。为了探究潜在原因，本文以反硝化途径中的关键酶——氧化亚氮还原酶为抓手，进一步探究微生物在高静水压下的生存机制。前人研究发现，氧化亚氮还原酶目前已经进化成两个谱系，即典型的进化枝I（nosZ I，其易位机制是双精氨酸易位(twin-arginine translocation, Tat)途径）和新型的进化枝II（nosZ II，其与分泌(secretory, Sec)易位途径相关）。根据文献调研发现，两个途径之间蛋白质易位的能量需求差异很大，Sec依赖型蛋白易位途径被认为比Tat依赖型更具有能量优势，即通过Sec途径时每20个氨基酸跨膜易位需要约1个ATP分子，而经Tat途径跨膜转运时的能量消耗相当于约10000个ATP分子。本研究采用异源表达手段，将这两种类型的nosZ基因簇序列分别导入到Shewanella piezotolerans WP3NR菌株中，在不同静水压下检测其转录和代谢活性。研究结果发现，Sec依赖型nosZ基因簇总是比Tat依赖型具有显著更高的N2O消耗量以及转录活性，尤其是在静水压为20 MPa和40 MPa的条件下（图4）。这一结果揭示了在高静水压力下微生物细胞更倾向于利用Sec易位途径以还原N2O。
图4. Tat依赖型和Sec依赖型nosZ基因簇在不同静水压下的代谢和转录活性差异
高静水压下微生物同时进行厌氧反硝化和有氧呼吸过程
在流动培养实验中，伴随着反硝化活性逐渐增强的情况下，参与末端氧还原的关键基因（如Cyo、Cyd、Cco和Cox）在所测试的静水压力下均活跃地进行转录（见原文附图）。本文基于Binning获得了流动培养系统中活跃执行硝酸盐还原过程的微生物（图5），进一步分析了不同静水压力下同时参与厌氧反硝化和有氧呼吸途径的基因组，发现包括Halomonas titanicae、Marinobacter hydrocarbonoclasticus和Thalassospira xiamenensis在内的微生物均能同时活跃地转录反硝化和有氧呼吸相关基因（见原文附表）。此外，为了证实自然的海沟环境中确实存在这种情况，本文分析了马里亚纳海沟原位RNA固定的表层沉积物（0-10 cm）的宏组学数据。宏组学结果表明，与好氧和厌氧能量代谢途径如呼吸电子传递链、反硝化和TCA循环等相关的基因在原位环境中同时进行活跃转录（图 6）。
图5. 基于binning重建的活跃参与硝酸盐还原途径的MAGs
图6. 来自马里亚纳海沟原位RNA固定的表层沉积物中活跃的微生物代谢途径
– 讨论 –
本研究观察到了有氧呼吸和反硝化过程同时存在且增加的静水压力能够促进微生物的反硝化活性，这一现象不仅在本研究培养实验中观察到，也在原位的深渊海沟环境中得到验证。之前的报道表明在沿海海洋渗透性沉积物中存在同时进行的氧气消耗和反硝化过程，然而本文首次报道了高静水压力促进了有氧条件下的反硝化。本文提出，高静水压力下增强的反硝化可能是为了满足能量保存需求和避免氧化应激反应。本研究获得了多种反硝化菌的MAGs，其存在的有氧呼吸相关基因和反硝化相关基因可以同时转录。这与先前的研究一致，即在海洋反硝化菌和硝酸盐还原菌中，能量代谢和高压适应是协调的。例如，在Halomonas titanicae ANRCS8122中，高静水压力刺激了一些能量代谢途径（如糖酵解、异化硝酸盐还原、反硝化和三羧酸循环）相关基因的转录活性。具有更高能量产生能力的海洋硝酸盐还原菌Caminibacter mediatlanticus和Thermovibrio ammonificans更能适应高静水压力。正如本研究所示，能量保存机制在反硝化途径中也观察到，Sec依赖型N2O还原酶优于Tat依赖型（图7）。类似的能量保存机制也已报道在极端环境耐受菌Pyrobaculum calidifontidis和Salinibacter ruber中，两者都含有Sec依赖型N2O还原酶。Sec依赖型nosZ基因的优势性也发生在寡营养的地下水环境中。此外，高静水压力诱导细胞内氧化应激，这损害了微生物细胞的生理功能。在氧化应激下，细胞更倾向于使用硝酸盐而不是氧气作为终末电子受体，以防止活性氧化物（ROS）进一步的积累。因此，即使在有氧条件下，用于细胞维持（maintenance）的能量保存和避免氧化应激可能是高静水压力下增强微生物反硝化活性而不是有氧呼吸的潜在机制之一。
沉积环境中的氧化还原分区通常被细分为有氧呼吸区、硝酸盐还原区、锰还原区、铁还原区、硫酸盐还原区和产甲烷区。有氧条件下高静水压增强的反硝化活性可能导致沉积物中典型含氮化学区带的深度变浅，从而增强氮流失（图7），进一步改变了深海沉积物的地球化学循环，这也将引起未来研究沉积物中其他厌氧还原过程的热点，包括锰、铁、硫酸盐还原和产甲烷作用等。对这种现象的认识将极大地拓宽人们对深渊海沟中关键元素的生物地球化学循环的理解，并开辟新的研究领域。
图7. 高静水压对深渊沉积物中氧化还原分区和氮转化的影响的概念模型
反硝化和厌氧氨氧化是导致海沟固定氮流失的主要途径，但具有明显的生境偏好。在全球海洋水柱中，厌氧氨氧化细菌的分布差异很大，但其更喜欢缺氧区域。报道称，在克马德克海沟和阿塔卡马海沟，最大的N2产生速率约为0.02-2 nmol N/(day·cm3)，且这两个生态系统都以厌氧氨氧化细菌为主。相比之下，反硝化菌在全球海洋中广泛分布，尤其在高有机物含量的沉积物中丰富存在。本文证明了当提供有机碳时，反硝化作用主导了持续的氮流失。类似的结果也在雅浦海沟和挑战者深渊沉积物中被报道。在实验室条件，70 MPa下以125 mL马里亚纳海沟沉积物为初始接种物（见原文方法部分），本文观察到由反硝化产生的氮流失（N-N2O）速率约为4.6 nmol N/day/mL。尽管由于技术限制，未能测量N2的产生量，但预计反硝化作用产生的N2将导致额外的氮流失。此外，完全的反硝化过程通常需要一个复杂的微生物consortium才能实现，可能会产生一系列副产物（NO2−、NO、N2O），这使得反硝化菌与其他微生物之间建立了合作关系。这表明，反硝化主导的生态系统可能比厌氧氨氧化主导的生态系统存在更丰富的微生物多样性，从而提供了维持海沟微生物多样性的可能机制。
在这里，本文证明了在高静水压力下，反硝化是有利的能量途径，并且主导了有氧表层沉积物中的氮流失。本文观察到高静水压力促进了有氧条件下的反硝化作用，表明静水压力有改变微生物的生境广度和活性的潜力。这种改变反过来会影响它们对海沟环境中元素循环过程的贡献。反硝化菌和厌氧氨氧化菌的分布差异以及不同的氮流失速率表明，在全球海洋底部可能存在着氮流失热点，亟待科研人员进行探究。
参考文献
Yang, N., Lv, Y., Ji, M. et al. High hydrostatic pressure stimulates microbial nitrate reduction in hadal trench sediments under oxic conditions. Nat Commun15, 2473 (2024).
– 作者简介 –
第一作者
上海交通大学
生命科学技术学院
杨娜
博士后
2023年于上海交通大学海洋学院获得博士学位，目前在本校生命科学技术学院继续从事博士后研究工作。主要关注深渊环境微生物多样性，高压下微生物氮代谢特征，深海微生物驱动氮代谢的分子机制等。目前共发表SCI论文6篇，其中以第一作者在Nature Communications、Applied Microbiology and Biotechnology、Frontiers in Physiology上发表论文3篇。
通讯作者
上海交通大学
海洋学院
张宇
研究员
研究方向：深海环境实验模拟与原位试验技术研发、深海微生物的生存策略和生态贡献研究，研制设备获专利授权10项，在Nature Communications，Current Opinion in Biotechnology，mBio等期刊发表论文40余篇，担任Science Bulletin、The ISME Journal等国际期刊编委。获得国家自然科学基金优秀青年科学基金、首批上海市基础研究特区计划等项目支持。参加极地、大洋科学考察累计作业600余天，担任“奋斗者”首个应用航次的首席科学家，获得美国NSF授予的南极考察勋章。
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